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    蛋白電泳儀遇到的問題及操作步驟
  • 發布日期:2023-07-17      瀏覽次數:393
    • 蛋白電泳儀遇到的問題及操作步驟-1.png


      分離膠濃度6%/8%/10%/12%/15%,搭配上層膠溶液B中的紅色或綠色染料,多種搭配任你選擇,蛋白點樣孔清晰可見,提高點樣效率。


      清洗玻璃板

      用洗滌劑清洗垂直電泳儀(SVE-2)玻璃板,清水沖洗兩次,再用純水(G4701-500ML)漂洗一次,自然晾干或者使用風扇吹干;


      配置分離膠和濃縮膠

      根據目的蛋白分子量和所選電泳緩沖液不同,選擇合適濃度的SDS-PAGE下層膠,參照表格:



      配制10% AP溶液:稱取AP(過硫酸銨)粉末0.1 g,用1 mL純水溶解。該溶液4℃存貯1-2周有效,-20℃保存3個月有效;

      根據實驗需求,等比例混合對應的溶液A和B,加入適量的10% AP溶液,分別配制下層膠溶液、上層膠溶液。不同規格以及不同厚度的玻璃板可以等比例調整上層膠和下層膠溶液的配制體積,以常用規格約8.3 cm×7.3 cm 凝膠板和10% SDS-PAGE彩色(紅色)凝膠超快速配制試劑盒為例,推薦配制體系如下表格:



      配膠試劑里面的 AP 需要根據實驗室實際溫度來適量的增加或者減少,比如夏天溫度較高自然凝膠速度較快,AP 的量需要適當的減少;冬天溫度低,凝膠慢,需要適量的增加。


      制膠 

      向兩塊玻璃板中間膠室中緩慢注入配制好的下層膠溶液至膠室的三分之二到四分之三處(根據實際實驗需求來定),然后使用雙蒸餾水左右移動均勻加至膠室內,使其起到密封作用(加樣時請務必小心,避免產生氣泡)。靜置15-30 min左右等待凝膠聚合,倒出雙蒸餾水,并用吸水紙清理膠室殘留液體。


      使用配制的上層膠溶液加樣灌滿膠室(高度至凹板玻璃缺口上沿),隨后插入加樣梳子。等待約15-30 min凝膠聚合后,制膠過程完成。


      上樣電泳 

      等濃縮膠凝固好,拔掉梳子,如果點樣孔彎曲,可用上樣針撥正,之后可上樣,Marker孔加入5-10μL蛋白Marker,其余蛋白總上樣量30-50μg。將制膠器放進電泳槽,倒入電泳緩沖液,連接電泳電源(PW-600),將電壓調至 60-90V ;樣品進入分離膠之后,將電壓調至 120-150V,等到溴酚藍指示劑距離膠最底部大約 1cm,即可終止電泳 (想要更快完成電泳實驗,或對小分子蛋白分離要求更高,建議選用G2081 SWE快速高分辨電泳緩沖液,可全程200-250 V恒壓,約30 min可完成電泳,大大節約時間,并且對小分子蛋白分離效果更好)。



      電泳相關常見問題和處理方法

      電泳步驟操作不當可能會導致條帶結果有問題,分享一些電泳相關常見問題和對應的處理方法,希望能給大家啟發和幫助~


      “微笑"現象


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      條帶出現微笑現象(中間凹兩邊翹起):主要由于凝膠中間部分凝固不均。

      處理方法:應待凝膠充分凝固后電泳,或者加入催化劑后充分混勻。


      拖尾現象


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      條帶出現拖尾現象:主要是樣本溶解效果不佳,或分離膠濃度過大,或電泳緩沖液放置時間過長。

      處理方法:加樣前離心;加適量的樣品促溶劑;降低凝膠濃度或使用梯度凝膠;重新配置電泳緩沖液。


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      條帶過粗:可能是上樣量過大;濃縮膠未濃縮好;濃縮膠pH值不正確;電壓過高。

      處理方法:減少上樣量;增加濃縮膠長度;保證濃縮膠的pH正確(6.8);降低電壓。


      紋理現象


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      條帶不整齊


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      條帶不整齊:

      可能是由于膠凝固不均勻,建議待膠凝固后上樣;

      可能是由于電泳的時候,有氣泡在膠的下邊緣,建議電泳前,檢查并趕走膠底部的氣泡;

      可能是由于上樣buffer不是工作液濃度,建議重新配置上樣buffer;

      可能是由于拔梳子導致樣品孔不齊,建議水平緩慢的拔梳子。


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